一、实验原理

破膜-分层-沉淀-洗涤-溶解

二、提取过程所需试剂

1．Trizol

Trizol的主要成分有苯酚、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇。苯酚裂解细胞，释放出细胞内含物DNA、RNA、蛋白质等； 8－羟基喹啉破坏RNase的活性，保护RNA；异硫氰酸胍蛋白变性剂，可以和苯酚一起破坏细胞膜； β-巯基乙醇，抑制RNase的活性。 

2．氯仿

氯仿即三氯甲烷，主要有两个作用，一个是变性蛋白质，一个是萃取，使水相和有机相的分离，RNA溶解于水相。在体系中加入Trizol和氯仿之后可以分为三层，下层是苯酚-氯仿相，上层是水相（含RNA），中间为蛋白相。 

3．异丙醇

主要用于沉淀水相之中的RNA。

4．乙醇

洗涤作用，可以清洗RNA中的有机物杂质，如异丙醇，氯仿。并且乙醇挥发性较强，易于清理，从而得到纯净的RNA。 

5．DEPC水

溶解RNA，DEPC水用二乙基碳酸酯（DEPC）处理过，去除了RNA酶污染。在溶解RNA的同时可以更好的保存RNA。

三、实验步骤

【注意】提RNA前务必清理台面，用酒精多喷几遍！！

1. 将细胞转移至离心管：消化细胞之后用适量培养基或者PBS重悬细胞，将细胞悬液转移到离心管中，离心之后弃上清液，沉淀中为细胞。

2. 加入Trizol和氯仿：在离心管中按照5:1的比例加入Trizol和氯仿，一般情况下每管加入500ul Trizol和100ul氯仿。加完之后剧烈震荡15s，一定要剧烈震动，可以用两个离心管架像奥利奥一样夹住离心管【奥（离心管架）-利（离心管）-奥（离心管架）】，然后像摇骰子一样剧烈的摇晃。一定要剧烈！ 

3. 静置离心：静置3min，然后离心12000rpm，4℃，离心10~15min。离心之后样品分成三层，上层是无色的水相，中间层是自色的，下层是粉红色的有机相。RNA主要是在水相中。 

4. 加入异丙醇：把水相转移到干净的离心管中，加入等体积的异丙醇。比如500ul的水相加入500ul的异丙醇，混匀后室温静置20min左右。 

5. 离心：离心12000rpm，4℃，离心10min，离心管底部会有白色沉淀，小心吸弃上清液 

6. 75%乙醇洗涤：每管加入1m175%乙醇对沉淀进行洗涤，可以颠倒混匀几次充分洗涤。酒精必须现用现配！

7. 离心，小心弃去上清液，注意不要吸走RNA沉淀。 

8. 敞开离心管的盖子，晾干RNA之后，加入适量的DEPC水在55℃溶解。 

9. 测浓度。

四、核酸提取浓度检测解读

1. A260：核酸的主要吸收峰

【意义】核酸（包括DNA和RNA）在260nm波长处有最大吸收峰。

【用途】用来估算核酸浓度。

核酸浓度（μg/mL）=A260 x 稀释倍数 x 系数

DNA的系数为 50μg/mL·OD

RNA的系数为40 ug/mL·OD

核酸浓度的精确度受到杂质（如蛋白质或化学物质）的影响，需要结合比值来评估纯度。

2. A280：蛋自质的吸收峰

【意义】蛋白质在280nm波长处有显著吸收，主要由色氨酸和酪氨酸残基决定。

【用途】通过检测核酸样品中280nm的吸收值，可以判断样品是否有蛋白质污染。

3. A230：化学污染的敏感指示

【意义】230nm附近的吸收主要来源于有机物、盐类和试剂残留（如苯酚、胍盐）。

【用途】检测样品是否受到化学污染。

4. 比值解读-A260/A280

【理想值】纯DNA的A260/A280比值约为1.8；纯RNA的A260/A280比值约为2.0。

【偏低】可能有蛋白质污染。

【偏高】可能有RNA或其他杂质混入。

5. 比值解读-A260/A230

【理想值】通常为2.0~2.2。

【偏低】可能有盐类、胍盐、苯酚等化学污染。

【偏高】可能是检测误差或样品稀释过度。

PS.以上比值并不绝对，试剂厂家对比值范围有不同的解读：

6. 检测数据的综合解读

A260/A280和A260/A230的意义：A260/A280比值主要反映蛋自质污染；A260/A230比值主要反映化学物质污染。

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